Anaerobní rozložitelnost organických látek a aktivita anaerobní biomasy

Anaerobní kal je z technologického hlediska zatím většinou posuzován jen jako materiál, sleduje se jeho množství, koncentrace, organický podíl a fyzikální vlastnosti, při hodnocení se uplatňují provozní a ekonomické dopady. Tento materiál je však oživen a právě mikroorganismy jsou hlavní akční silou celého procesu likvidace organického znečištění. Běžně sledované vlastnosti kalu se nemusí vůbec změnit a přesto dochází k podstatným změnám v účinnosti a průběhu procesu, když mikroorganismy zareagují na nějaký vnější podnět. Proto je velmi důležité znát něco víc o aktivitě mikrobiálního společenství jako celku i jeho jednotlivých mikrobiálních skupin.

Abychom dokázali posoudit v jakém stavu se proces rozkladu právě nachází, je nutné znát aktuální stav dílčích rozkladných procesů, který odpovídá biochemické i fyziologické aktivitě příslušných mikroorganismů. K získání těchto informací je ovšem důležité mít takové technologické metody sledování anaerobní biomasy, které by to umožňovaly.

Uplatnění technologických metod testování anaerobní biomasy je velmi široké, nejenom při kontrole funkčních provozních zařízení, ale i při charakterizaci kalů, výběru vhodného inokula, při sledování adaptace a aklimatizace kalů, při posuzování vlivů různých podmínek procesu, při rozhodování pro použití anaerobní technologie a pro počáteční odhad technologických parametrů (Zábranská et al., 1988a).

Neméně důležité jsou i nároky na technické provedení testů vzhledem k účelu testování. Metody by neměly vyžadovat složitá zařízení, neměly by být časově náročné a měly by přinášet co nejvíce požadovaných informací. Jak vyplývá z předchozích kapitol o složitosti a různorodosti anaerobního mikrobiálního ekosystému, všechny tyto požadavky splnit je velice obtížné, ne-li nemožné.

Hlavní problémy anaerobních aktivitních testů ve srovnání s aerobními přináší nutnost sledovat nejenom kapalnou fázi, ale i plynnou fázi a jejich vzájemně si odpovídající změny. Ke změnám v plynné fázi dochází vlivem produkce metanu a oxidu uhličitého, respirace vodíku a spotřebě oxidu uhličitého. Anaerobní podmínky testů vyžadují práci v uzavřeném prostoru, se známým objemem plynového prostoru, s odstraněním kyslíku z plynné fáze. Při sledování kinetiky anaerobního rozkladu, kdy je třeba odebírat vzorky k analýzám v určitých časových intervalech, dochází ke změnám objemu kapaliny, objemu nebo tlaku plynu a kvality plynu, což je nutné neustále brát do úvahy a zahrnout do výpočtů při hodnocení testu. Dále nelze jednorázově stanovit návaznost a funkci jednotlivých trofických skupin mikroorganismů.

Další technický problém přináší zvýšená teplota testů, které jsou většinou prováděny při mesofilních podmínkách. Přesné udržování konstantní teploty potom není tak nutné kvůli mikroorganismům, ale pro přesné odečítání objemů nebo tlaků vyprodukovaných plynů. Na způsobu a přesnosti měření závisí ve velké míře spolehlivost a reprodukovatelnost testu.

Vzhledem k již zmíněným nízkým rychlostem růstu anaerobních mikroorganismů a pomalému metabolismu přistupuje navíc dlouhá doba trvání testu. 

Metody stanovení aktivity anaerobních mikroorganismů

Pro stanovení aktivity anaerobních mikroorganismů se většinou volí jednorázové testy. Jsou jednodušší, méně náročné na čas, obsluhu a zařízení. Díky tomu umožňují posuzování většího počtu proměnných, získané výsledky je složitější vyhodnotit a někdy bývají orientačním podkladem pro provedení testů kontinuálních.

Kontinuální testy sice lépe odpovídají provozním podmínkám, především jsou to stálé hodnoty koncentrace substrátu a látkového zatížení biomasy. Jsou však složitější v provedení a většinou bývají spojeny s konkrétním problémem, který modelově řeší. Výsledky jsou technologicky spolehlivější, protože lze s jejich pomocí sledovat dynamickou rovnováhu procesu. V kontinuálních testech je zahrnut i růst bakterií a jeho změny, naopak u jednorázových testů se volí podmínky tak, aby ho bylo možno při hodnocení zanedbat.

Jednorázové testy se dělí podle toho, která oblast procesu je vybrána pro indikaci změn - substrát, mikroorganismus nebo produkt.

Sledování koncentrace substrátu se volí většinou tam ,kde jde o specifickou látku, obvykle nesnadno rozložitelnou, kdy potřebujeme znát rychlost jejího rozkladu, eventuelně skladbu rozkladných meziproduktů. Tento způsob testování je svázán se speciálními analytickými technikami, protože skupinové stanovení organických látek je v tomto případě nedostačující (Zábranská et al., 1987, 1991a).

Pokud se soustředíme na samotné mikroorganismy, používané metody stanovení aktivity jsou většinou svázány s vnitřními pochody v buňce a týkají se enzymů a jejich kofaktorů nebo prosthetických skupin. Sem patří stanovení dehydrogenázové aktivity nebo stanovení koenzymu F420 (Zábranská a Dohányos, 1987) a nově zaváděné imunochemické metody.

Koncentrace biomasy se vzhledem k pomalým růstovým rychlostem anaerobních mikroorganismů během testu příliš nemění, relativně malé objemy testovaného media nedovolují stanovit její změny s dostatečnou přesností. Proto jsou údaje o změnách koncentrace biomasy v testu považovány pouze za orientační.

V oblasti produktů je jednoznačně nejvíce sledována plynná fáze. Indikátorem aktivity je produkce bioplynu nebo produkce metanu a aktivita celého mikrobiálního ekosystému je vyjádřena situací konečné fáze anaerobního rozkladu - metanogenese (Zábranská et al., 1990). Tyto testy jsou proto nazývány testy metanogenní aktivity (TMA). 

Stanovení plynného i rozpuštěného vodíku

Jakákoli změna podmínek procesu, která poruší dynamickou rovnováhu produkce a spotřeby vodíku v systému, se okamžitě projeví zvýšením koncentrace vodíku v kapalné a následně i plynné fázi. Výskyt a množství vodíku v bioplynu je rychlým a citlivým indikátorem stavu procesu a je důležitým faktorem pro jeho řízení.

K využití uvedených poznatků je třeba disponovat takou metodou, která je schopna rychle a s dostatečnou přesností stanovit vodík v co nejnižší koncentraci vedle ostatních složek bioplynu. Požadovaných nároků bylo dosaženo použitím argonu jako nosného plynu, protože má nejvyšší rozdíl tepelné vodivosti vůči vodíku, a využitím dvoukolonového uspořádání chromatografu (Zábranská et al., 1988a).

Při dostatečné aktivitě hydrogenotrofních mikroorganismů je produkovaný vodík prostřednictvím mezidruhového transportu okamžitě spotřebován a v plynné fázi se neobjeví. Přesto je možno velice přesně stanovit aktivitu hydrogenotrofních mikroorganismů měřením rychlosti spotřeby rozpuštěného vodíku v kapalné fázi.

K tomuto účelu bylo vyvinuto zařízení schopné měřit koncentrace rozpuštěného vodíku ve vodném prostředí. Principem je Clarkova kyslíková sonda s obrácenou polarizací a výkonnějším zesilovačem vznikajícího proudu. Přístroj je schopen zpracovat signál sondy v rozsahu 0-200 µmol/l H2. Tento způsob měření hydrogenázové aktivity anaerobních mikroorganismů je prováděn za fyziologických podmínek sledované kultury, nedochází k rušivým zásahům do měřeného media. Lze kontinuálně sledovat změny v aktivitě v závislosti na změně kultivačních podmínek. Po skončení testu lze biomasu vrátit do procesu, což je důležité zvlášť u nízkoobjemových laboratorních modelů s malou zásobou biomasy (Zábranská et al., 1985a).

Stanovení koenzymu F420

Koenzym F420 je nízkopotenciálový elektronový přenašeč v metabolismu anaerobních bakterií a je většinou napojen na dehydrogenázové systémy. Je unikátním koenzymem vyskytujícím se pouze u metanogenních mikroorganismů, který se zúčastňuje redukce CO2 na CH4. Koenzym F420 vykazuje silnou fluorescenci při excitační vlnové délce 420 nm a této vlastnosti se využívá při jeho stanovení. Koncentrace koenzymu F420 lze použít pro odhad zastoupení metanogenních mikroorganismů v anaerobní biomase a pro stanovení jejich aktivity.

Byla vypracována metodika fluorescenčního stanovení koenzymu F420 v anaerobních kalech. Interpretace výsledků však není jednoduchá, protože koenzym F420 fluoreskuje pouze v redukované formě a jeho obsah se mění podle typu metanogenního mikroorganismu (Zábranská et al., 1983). Hydro-genotrofní metanogeny, protože daleko více využívají dehydrogenázové systémy při redukci CO2 mají také mnohem vyšší specifický obsah koenzymu F420 a nelze tedy pouze podle absolutní koncentrace koenzymu zjištěné podle intenzity fluorescence soudit na kvantitativní zastoupení metanogenů v biomase. Relativní změny koncentrace koenzymu při sledování jednoho typu anaerobní biomasy jsou však velice těsně spojeny s aktivitou metanogenů a podmínkami procesu a podávají cenné informace (Zábranská et al., 1985b, 1985c).

Dehydrogenázová aktivita anaerobních mikroorganismů

V závislosti na typu organismu a elektronového přenašeče mohou jako konečný elektronový akceptor fungovat různé látky. Enzymový systém vždy přednostně katalyzuje tu reakci, která má vyšší energetický výtěžek. Tím dochází k přirozené následnosti biochemických redox reakcí. Tato následnost nezahrnuje činnost pouze jediného organismu, ale je činností směsné mikrobiální kultury a závisí na adaptaci různých druhů mikroorganismů na různé akceptory. To znamená, že podle dostupného akceptoru se mohou aktivizovat rozdílné skupiny mikrobiální populace.

Nerovnovážný stav elektronového transportního systému je prvním signálem nestability následných redox reakcí a tím anaerobního rozkladu probíhajícího v reaktoru. Tato situace předchází dalším signálům nestability procesu jako je pokles pH, vzrůst koncentrace mastných kyselin a pokles produkce metanu. Aktivita různých důležitých dehydrogenázových systémů může být proto užitečná pro charakterizaci anaerobní biomasy a odhad aktuální situace jednotlivých trofických skupin mikroorganismů.

Při stanovení dehydrogenázové aktivity pomocí tetrazoliových solí je využito redukce těchto sloučenin na formazany, což je spojené s barevnou změnou. Redukčním činitelem je vodík, uvolněný dehydrogenázami při oxidaci substrátu. Dosahované výsledky jsou závislé na mnoha faktorech. Z těch nejdůležitějších to jsou pH, teplota, koncentrace TTC, koncentrace substrátu, koncentrace biomasy, doba inkubace.

Dehydrogenázovou aktivitu mikroorganismů (DHA) můžeme rozdělit na endogenní a substrátovou. Endogenní DHA definujeme jako DHA mikroorganismů bez přídavku vnějšího substrátu. Substrátová DHA je DHA mikroorganismů po přídavku určitého substrátu.Výběrem substrátu můžeme aktivizovat různé trofické skupiny mikroorganismů. V metodě se jako substrát používá glukosa, kyselina mravenčí, kyselina octová a kyselina propionová. Glukosa je substrátem pro fermentační mikroorganismy, kyselina mravenčí pro hydrogenotrofní metanogeny, kyselina octová pro acetotrofní metanogeny a kyselina propionová pro aktivizaci syntrofních acetogenů (Zábranská et al., 1991a).

Z provedených testů lze soudit na zastoupení a aktivitu jednotlivých mikrobiálních společenstev a odhadnout jejich aktuální zatížení substrátem a volnou degradační kapacitu.

Testy produkce bioplynu - testy metanogenní aktivity

Podle požadovaného účelu se testy metanogenní aktivity dělí do několika skupin:

  1. testy výtěžnosti metanu nebo bioplynu
  2. testy maximální rychlosti produkce metanu nebo bioplynu
  3. stanovení maximálního zatížení anaerobní biomasy
  4. stanovení aktivity funkčních skupin anaerobní biomasy
  5. testy toxicity nebo adaptace anaerobní biomasy
  6. technologické testy účelové

Každý jednotlivý typ testu vyžaduje určité uspořádání a technické provedení testu a jiný způsob vyhodnocení výsledků. Uplatnění metod testování anaerobní biomasy je velmi široké, nejenom při kontrole funkčních provozních zařízení, ale i při charakterizaci kalů, výběru vhodného inokula, při sledování adaptace a aklimatizace kalů, při posuzování vlivů různých podmínek procesu, při rozhodování pro použití anaerobní technologie a pro počáteční odhad technologických parametrů (Zábranská, 1994).

Základní technické provedení jednorázových testů pro všechny uvedené účely je stejné, liší se pouze v detailech dávkování substrátu, biomasy a v podmínkách testu. Pro testy se používá uzavřených lahví nebo měrných baniček, do nichž se stanoveným anaerobním způsobem nadávkuje anaerobní biomasa jako inokulum a definované medium zajišťující požadované podmínky testu. Pro sérii testů je velmi důležité připravit dostatečnou zásobu inokula stejných vlastností, někdy i zvlášť kontinuálně kultivovaného na sledovaných odpadních vodách. Základem pro vyhodnocení všech testů je referenční pokus, kde měříme produkci plynu pouze z inokula - endogenní.

Hlavní problémy anaerobních aktivitních testů ve srovnání s aerobními přináší nutnost sledovat nejenom kapalnou fázi, ale i plynnou fázi a jejich vzájemně si odpovídající změny. Ke změnám v plynné fázi dochází vlivem změn rovnováhy mezi produkcí metanu, oxidu uhličitého a vodíku a spotřebou oxidu uhličitého a vodíku.

Anaerobní podmínky testů vyžadují práci v uzavřeném prostoru, se známým objemem plynového prostoru, s odstraněním kyslíku z plynné fáze. Při sledování kinetiky anaerobního rozkladu, kdy je třeba odebírat vzorky k analýzám v určitých časových intervalech, dochází ke změnám objemu kapaliny, objemu nebo tlaku plynu a kvality plynu, což je nutné neustále brát do úvahy a zahrnout do výpočtů při hodnocení testu. Dále nelze pouze v jednom testu stanovit návaznost a funkci jednotlivých trofických skupin mikroorganismů. Vzhledem k již zmíněným nízkým rychlostem růstu anaerobních mikroorganismů a pomalému metabolismu přistupuje navíc dlouhá doba trvání testu.

Další technický problém přináší zvýšená teplota testů, které jsou většinou prováděny při mezofilních podmínkách.Při inkubaci musí být udržována konstantní teplota, většinou se používá 35oC. Přesné udržování konstantní teploty není nutné jenom kvůli mikroorganismům, ale zejména pro přesné odečítání objemů nebo tlaků vyprodukovaných plynů. Na způsobu a přesnosti měření závisí ve velké míře spolehlivost a reprodukovatelnost testu.

Testovací nádobka má mít možnost odběru vzorku plynu k analýze pomocí injekční stříkačky, může být kontinuálně míchána magnetickým míchadlem nebo diskontinuálně protřepáním před každým měřením. Pro spolehlivé výsledky je důležité přesné množství vzorku a poměr kapaliny a plynového prostoru. Zvětšením tohoto poměru se dosáhne vyšší přesnosti stanovení u vzorků s nízkou produkcí metanu. Dále je nezbytné pracovat s paralelně nasazenými testy, minimálně dvakrát.

Produkce plynu se měří denně, zpočátku i v kratších intervalech. Po 30 dnech dojde u většiny látek k úplnému rozkladu. Jsou však i látky, které vyžadují delší dobu. Realizace sledování produkce plynu je dána dostupným technickým vybavením laboratoří. Nejčastěji je používána metoda s objemovým měřením produkce bioplynu pomocí plynové byrety, ovšem s možností jeho odběru a následné chromatografické analýzy. Je možná i modifikace s absorpcí vznikajícího CO2. Obsah metanu se zjišťuje vedle přímé chromatografické analýzy, pokud není možná, nepřímo porovnáním produkce celkové a po absorpci CO2. Do paralelní testovací nádobky se do plynového prostoru umístí pevný KOH, který vznikající CO2 váže.

Všechny diskontinuální metody měření produkce plynu mají společné velké nároky na obsluhu   nutnost odečítání produkce plynu v byretě, objemu vyteklé vody při vytěsňovací metodě měření plynu, odebírání plynu k chromatografické analýze apod. Toto ovlivňuje četnost analýz a snižuje přesnost stanovení produkce metanu hlavně v počátečním stádiu testu a při testech trvajících pouze několik dní.

Vyřešení těchto problémů je použití tlakového čidla, které změnu tlaku převádí na elektrický signál, který je možno po zpracování kontinuálně zaznamenávat. Záznam i vyhodnocení dat včetně automatického systému ovládání je možno řídit počítačem. Tento systém dovoluje nezávislé a kontinuálně sledované testy mnoha vzorků, získaná data mohou být okamžitě zobrazována graficky. Anaerobní nádobky vzhledem k citlivosti tlakových čidel mohou být i velmi malé - v desítkách ml. V praxi to znamená použít pro každou nádobku jen 30   40 mg zkoumaného kalu, což umožňuje testovat i kaly z laboratorních modelů, kterých bývá omezené množství. Přístroje s tlakovými snímači pro měření vzrůstu tlaku produkovaného plynu však nejsou zatím komerčně snadno dostupné.

Pokud je anaerobní biomasa semikontinuálně kultivována v laboratorních modelech reaktorů s větším objemem (5-20 l), je možno její aktivitu stanovit přímo během sledování jednoho cyklu.

Analýzy, symboly a výrazy, používané v anaerobních testech:

inokulum - anaerobní kal jako zdroj funkční polykultury anaerobních mikroorganismů, jako přibližný odhad koncentrace biomasy v anaerobním kalu - X - je používán údaj NLorg - organické nerozpuštěné látky (ztráta žíháním nerozpuštěných látek) [g/l], platí hlavně pro suspenzní kulturu a rozpustný substrát

So - substrát - množství organických látek přidaných na počátku testu (CHSK, veškeré látky - VL, organický podíl VL - VLorg)

CHSK,VL přivedené (CHSKp,VLp) - [g/l], [mg] - koncentrace nebo množství substrátu přidané na začátku testu

CHSK,VL pozadí - [g/l], [mg] - koncentrace nebo množství rozpuštěných organických látek v referenčním pokusu na začátku testu

CHSK,VL celkové počáteční (CHSKo,VLo) - [g/l], [mg] - celková koncentrace nebo množství na začátku testu (pozadí + přivedené)

CHSK,VL zbytková (CHSKz,VLz) - [g/l], [mg] - koncentrace nebo množství v kapalné fázi po ukončení testu

CHSK,VL odstraněné (CHSKod,VLod) - [g/l], [mg] - rozdíl mezi hodnotou celkovou počáteční a zbytkovou po ukončení testu

počáteční zatížení inokula - So/Xo - CHSK,VL přivedené na jednotku NLorg anaerobního kalu - inokula - [g/g]

celková produkce bioplynu nebo CH4 (VBPc, VCH4c) - [ml] - objem vyprodukovaného bioplynu nebo CH4 v testu

endogenní produkce bioplynu nebo CH4 (VBPe, VCH4e) - [ml] - objem vyprodukovaného plynu nebo CH4 v referentním testu, kde je pouze anaerobní biomasa - inokulum, eventuelně pufr a mikroživiny bez přidání vnějšího substrátu

substrátová produkce bioplynu nebo CH4 (VBPs, VCH4s) - [ml] - objem vyprodukovaného plynu nebo CH4 po odečtení endogenní produkce z celkové produkce, objem bioplynu nebo CH4 vzniklé rozkladem přidaných organických látek

výtěžnost bioplynu nebo CH4 z CHSK (YBP,CHSK, YCH4,CHSK) - [l/g], [m3/kg] - maximální objem vyprodukovaného plynu [l] z 1 g CHSK přidaného substrátu

výtěžnost bioplynu nebo CH4 ze sušiny (YBP,VL, YCH4,VL) - [l/g], [m3/kg] - objem vyprodukovaného plynu [l] z 1 g VL

produkční aktivita kalu (Px) - produkce bioplynu na jednotku NLorg anaerobního kalu - inokula - [l/g], v závislosti na počátečním zatížení podává informaci o limitaci množstvím biomasy

specifická produkční aktivita kalu (Px,s) - specifická produkce bioplynu z jednotky CHSK nebo VLorg substrátu na jednotku NLorg anaerobního kalu [l/g.g], udává aktivitu kalu v závislosti na rozložitelnosti daného substrátu, zvyšuje se v průběhu adaptace nebo aklimatizace biomasy, užívá se pro hodnocení a porovnání různých typů kalů

specifická rychlost produkce bioplynu nebo metanu (rX,BP), (rX,CH4) - [l/g.h] (BP,CH4, NLorg), rychlost produkce bioplynu nebo metanu v určitém časovém úseku, vztažená na hmotnostní jednotku biomasy

maximální specifická rychlost produkce bioplynu nebo metanu (rX,BP,max ), (rX,CH4,max) - [l/g.h] (BP,CH4, NLorg), maximální rychlost produkce bioplynu nebo metanu, vztažená na hmotnostní jednotku biomasy.

a) Testy maximální výtěžnosti metanu nebo bioplynu

Účelem je zjistit maximální množství vyprodukovaného metanu nebo bioplynu na hmotnostní jednotku zkoumaného materiálu - YCH4,S, YBP,S [l/g, m3/kg] (S = CHSK, VL, VLorg). Zkoumaný materiál je jediným substrátem v testu, podmínky rozkladu jsou optimální - zajištěny přídavkem fosfátového pufru (pH 7) a živin, inokulum je standardní biomasa - všechny základní funkční skupiny mikroorganismů jsou aktivní, pozadí je nízké - inokulum obsahuje málo nebo žádné rozložitelné organické látky, které nejsou biomasa. Testy se nasazují při několika počátečních zatíženích biomasy So/Xo a vyhodnocují z oblasti lineární závislosti produkční aktivity biomasy Px na zatížení.

Do měrných nádobek se nadávkuje známé množství inokula a definované medium obsahující pufr, makro i mikronutrienty (N,P,Fe,Co,Ni a pod.). Toto medium zajišťuje, aby se nestal při testu limitujícím faktorem nedostatek živin. Směs se probublá dusíkem, aby jím byl plynový prostor naplněn a nechá se několik hodin vytemperovat a ustálit. Poslední přidanou složkou reakční směsi je sledovaná látka, která je jediným zdrojem uhlíku pro anaerobní kulturu, přidává se vytemperovaná na teplotu kultivace, čas jejího přidání zároveň s vyrovnáním tlaku uvnitř nádobky s tlakem atmosférickým je startem testu. Celkový objem kapalné fáze je VL.

Testovaná směs je kultivována při konstantní teplotě 35oC a je diskontinuálně promíchávána. Produkovaný plyn je v potřebných časových intervalech měřen tlakovými senzory nebo objemově po vyrovnání tlaku uvnitř nádobky s atmosférickým tlakem. Testy jsou vždy nasazeny duplicitně a uváděné výsledky jsou průměrem obou hodnot. Pro zjištění kvality bioplynu je prováděna podle potřeby chromatografická analýza plynné fáze. Po skončení testu je provedeno stanovení zbytkové CHSK.

Test je ukončen, když substrátová produkce plynu se již konstantní - dále se s časem nezvyšuje, čili účinnost rozkladu za daných podmínek je maximální.

Výtěžnost bioplynu vypočítáme ze substrátové produkce VBPs (rozdílu objemu celkové a endogenní produkce bioplynu), dělené počátečním množstvím přidaného substrátu (CHSK, VL, VLorg).

YBP = (VBPc - VBPe)/S = VBPs/S [l/g, m3/kg]

Výtěžnost metanu vypočítáme ze substrátové produkce metanu, děleného počátečním množstvím přidaného substrátu (CHSK, VL, VLorg).

YCH4,g = (VCH4c - VCH4e)/S = VCH4s/S [l/g, m3/kg]

Výtěžnost bioplynu nebo metanu je velmi důležitým údajem pro organické znečišťující látky v odpadních vodách a kalech, zejména pro návrh anaerobní technologie a dále pro odhad produkce bioplynu pro ekonomická a energetická hodnocení navržené technologie.

b) Testy maximální rychlosti produkce metanu nebo bioplynu

Účelem je zjištění maximální rychlosti produkce bioplynu nebo metanu na hmotnostní jednotku biomasy - maximální specifické rychlosti rX,BP,max, rX,CH4,max [l.g-1.h-1](CH4, NLorg). Pro hodnocení aktivity biomasy je nutno rychlost vyjádřit ve vztahu k její koncentraci.

Pro měření musí být zajištěny optimální podmínky rozkladu a přebytek substrátu v měřeném časovém úseku, limitujícím faktorem je pouze zkoumaná biomasa. Pracovní postup, manipulace s biomasou a substrátem i měření produkce plynu u jednorázových testů je stejné jako u testů výtěžnosti. Doba měření je však kratší, protože není nutné sledovat produkci plynu až do vyčerpání substrátu. Pokus je možno ukončit, jakmile rychlost produkce plynu začne klesat.

Maximální specifickou rychlost produkce je možno stanovit i během semikontinuálního provozu přímo v reaktoru. Měření produkovaného bioplynu je prováděno odpovídajícím plynoměrem, jeho kvalita se stanovuje na plynovém chromatografu. Pro vyhodnocení výsledků je nutné ve sledovaném cyklu určit počáteční koncentraci biomasy v reaktoru, počáteční a konečnou CHSK kapalné fáze, pH a kyselinovou neutralizační kapacitu.

Maximální objemovou rychlost produkce plynu rV,BP,max určíme jako směrnici tečny ke křivce produkce v závislosti na čase dělenou objemem kapalné fáze v oblasti maximální rychlosti bez limitace substrátem podle vztahu:

rV,BP,max =VBPc/ t.VL [l/l.h]

Specifickou maximální rychlost rX,BP,max získáme podělením rV,BP,max koncentrací biomasy:

rX,BP,max = rV,BP,max/X [l/g.h] (BP,CH4, NLorg)

Specifickou maximální rychlost rX,CH4max získáme vynásobením rX,BP,max objemovým zlomkem metanu v bioplynu.

Údaj rX,BP,max nebo rX,CH4,max představuje potenciální (maximálně možnou) aktivitu biomasy za daného stavu systému.

c) Stanovení maximálního zatížení anaerobní biomasy

Cílem testu je odhad maximálního zatížení dané anaerobní biomasy a zatížení pro dosažení požadované účinnosti rozkladu substrátu. Pro měření musí být zajištěny stejné podmínky jako pro stanovení rX,BPmax nebo rX,CH4max, dále je potřeba znát výtěžnost bioplynu nebo metanu zkoumaného materiálu a koncentraci biomasy X.

Maximální zatížení biomasy se vypočítá ze vztahů:

Bx,max = rX,CH4max. 24/YCH4,g [kg/kg d]

Bv,max = Bx,max . X [kg/m3.d]

Tento postup je vhodný pro jednoduché substráty a směsi substrátů s dobrou nebo podobnou rozložitelností. Pokud je zkoumaným substrátem materiál se širokou škálou organických látek s různou rozložitelností, rozklad probíhá postupně s rychlostmi odpovídajícími rozložitelnosti látek. Potom zatížení, které zaručí požadovanou účinnost E se počítá z průměrné rychlosti rX,CH4,E podle vztahů:

Bx,E = rX,CH4E . 100 /YCH4,g E [kg/kg d]

rX,CH4E = VCH4,s . tE-1 / X . VL [m3/kg.d]

d) Aktivita funkčních skupin anaerobní biomasy

Postup pro zjištění aktivity základních funkčních skupin anaerobní biomasy je stejný jako při stanovení rXmax. Ke zkoumané anaerobní biomase se přidávají substráty specifické pro jednotlivé funkční skupiny (na př. kyselina octová, mravenčí, propionová, benzoová, glukosa a pod.) a sleduje se křivka produkce bioplynu a koncentrace metanu. Z křivky produkce se vyhodnotí rXmax pro jednotlivé substráty, získané údaje jsou odhadem aktivity skupiny mikroorganismů zpracovávající daný substrát. Porovnáním s údaji uváděnými pro čisté nebo obohacené kultury je možno odhadnout kvantitativní zastoupení dané mikrobiální skupiny v biomase.

e) Testy toxicity nebo adaptace anaerobní biomasy

Určení toxicity dané látky se liší se od testu výtěžnosti pouze tím, že kromě látky je do každé testovací nádobky přidán standardní substrát. Inhibice způsobená látkou se určuje jako pokles produkce plynu vztažený k referentním pokusům bez přidání testované látky. Pro každý test se spočítá produkce plynu za stejný časový úsek a porovná se s průměrnými hodnotami z kontrolních testů. K testování látky se vybírá 5-10 koncentrací, cílem je zjistit rozsah koncentrací od neinhibujících až po silně toxické. Pro komplexní testy toxicity se používá více standardních substrátů podle jednotlivých mikrobiálních skupin. Potom je možno z testů toxicity odhadnout, která funkční skupina je sledovanou látkou nejvíce ovlivněna.

Výsledky se uvádějí jako procentuální snížení rychlosti produkce plynu nebo vyprodukovaného objemu plynu v porovnání s referentním testem. Vztahují se buď ke koncentraci látky nebo k specifické koncentraci látky vztažené na organickou sušinu biomasy.

f) Technologické testy účelové

Technologické testy jsou prováděny ve větších objemech, inokulum ani dávkované substráty nejsou ředěny, není přidáván pufr ani mikroživiny pro optimální prostředí a tím jsou částečně simulovány reálné podmínky. Způsob manipulace s materiálem, analýzy, měření a vyhodnocování výsledků je podobné jako u testů metanogenní aktivity a řídí se účelem testu. Vhodné uspořádání umožňuje odebírat i vzorky kapalné fáze během testu, umožňuje modelovat různé varianty očekávané reálné situace a podle výsledku zvolit optimální řešení. V případě, kdy je třeba odebírat vzorky k analýzám v určitých časových intervalech, dochází ke změnám objemu kapaliny, objemu nebo tlaku plynu a kvality plynu, což je nutné neustále brát do úvahy a zahrnout do výpočtů při hodnocení testu.

Zhodnocení a porovnání metod stanovení aktivity

Pro rychlé zjištění aktuálního stavu biomasy, aktivity jednotlivých mikrobiálních skupin, jejich relativního zatížení a volné degradační kapacity je nejvýhodnější stanovení dehydrogenázové aktivity. Výsledky je možno získat řádově v hodinách, což nelze dosáhnout žádnou jinou metodou. Je to velice užitečná metoda charakterizace anaerobní biomasy.

Metody měření rychlosti spotřeby rozpuštěného vodíku hydrogeno-trofními mikroorganismy jsou vhodné pro sledování aktivity biomasy ve speciálních případech, kdy jsou tyto organismy dominujícími metanogeny. Přichází to v úvahu hlavně při anaerobním čištění průmyslových odpadních vod obsahujících metanol, formaldehyd a podobné jednouhlíkaté látky jako aminy a podobně.

Stanovení fluorescenčního koenzymu F420 jako míry aktivity metano-genních mikroorganismů je metoda vysoce specifická a náročná, její použití není tak časté a leží spíše v oblasti výzkumu než technologické praxe. Byla však v některých případech úspěšně aplikována i v technologii.

Z hlediska jednoduchosti, přesnosti a spolehlivosti anaerobního testu je nejvhodnější sledování nepřímé podle produkce plynu - testy metanogenní aktivity.

Pro porovnání výpovědní schopnosti obou nejčastěji používaných testů (DHA a MA) je třeba brát v úvahu následující skutečnosti.Test DHA je krátkodobý test, standardní provedení testu používá 1 hod. kultivace biomasy, při zjišťování rychlosti rozkladu se používá paralelní stanovení s prodloužením doby exposice na 2 hod. i více, podle aktivity a koncentrace zkoumaného kalu. Podává informace o okamžitém stavu, aktivitě a zatížení dehydrogenázových systémů jak směsné kultury jako celku, tak jeho jednotlivých trofických skupin. Podle přidaného substrátu je během testu DHA aktivován a dává odezvu ten systém, který se přímo podílí na rozkladu příslušného substrátu, ať je to v kterékoli fázi rozkladu.

Další důležité hledisko, které je nutno uplatňovat při hodnocení DHA testu, je schopnost a možnost regenerace dehydrogenázových systémů při vysokém zatížení buněk substrátem. Aby mohl dehydrogenázový systém fungovat, musí být jeho přenašeče vodíku (na př. NADH) neustále regenerovány, což se děje jinými biochemickými reakcemi. Odpovídající redox reakce musí být v určité dynamické rovnováze, aby proces rozkladu mohl probíhat žádoucím směrem. Pokud dojde k přetížení systému, rovnováha se poruší, regenerace přenašečů neprobíhá potřebnou rychlostí a tím výsledek DHA testu je nízký. V případě takového přetížení potom nesouhlasí výsledky DHA testu s MA testem, protože produkce plynu se zatížením biomasy roste. Při enormním přetížení sice potom také klesá, ale při nesrovnatelně vyšších hodnotách koncentrace substrátu.

Zásadní rozdíl mezi DHA a MA testem spočívá v tom, že test MA je založen na sledování produkce bioplynu, což je produkt konečné metanizační fáze anaerobního rozkladu. V předmetanizační fázi vzniká CO2 a H2 , které přispívají k produkci plynu, pokud je inhibována nebo blokována metanizační fáze. Proto je velice důležité kontrolovat složení vznikajícího bioplynu analýzami na plynovém chromatografu.

Produkce bioplynu může být naopak velice nízká i při plné metanogenní aktivitě biomasy, pokud je nějakým způsobem limitována tvorba přímých metanogenních substrátů. To může být způsobeno pomalým a nesnadným rozkladem testovaného substrátu nebo inhibicí a poškozením mikroorganismů předmetanizační fáze i při lehce rozložitelném substrátu. Dále doba testu metanogenní aktivity je mnohem delší než u testu DHA, může tedy dojít k určitým změnám ve složení a aktivitě biomasy a při porovnávání a hodnocení konečných výsledků se tyto testy nemusí vždy shodovat.

I přes uvedené odlišnosti testy DHA a MA udávají ve většině případů stejné hodnocení a lze podle průběhu DHA testu odhadnout pravděpodobné chování anaerobní biomasy při testu produkce bioplynu. Toto platí hlavně pro případy nižšího a středního zatížení biomasy substrátem. Pokud tedy hodnotíme a srovnáváme výsledky obou testů s biomasou pracující za vysokého zatížení, nelze používat hodnocení podle absolutní hodnoty DHA (CfX), která je zkreslena nedostatečnou regenerací dehydrogenázových systémů, ale podle relativní odezvy vyjadřující zatížení biomasy. Potom výsledky testů produkce plynu jsou ve velmi dobré shodě s výsledky DHA testu.

Metodika stanovení aktivity anaerobní biomasy je velmi různorodá, jednotlivé přístupy se liší náročností provedení i výpovědní schopností. Z hlediska širší technologické aplikace se nejvíce osvědčily testy dehydrogenázové aktivity a testy produkce bioplynu, ať už aplikované na technologické hodnocení anaerobních kalů nebo na stanovení rozložitelnosti organických látek.

Testy mohou přispět k rychlému a správnému rozhodnutí v provozním měřítku, kdy se výsledek projeví jak ekonomicky ve snížení investičních nebo provozních nákladů, tak ekologicky ve zkrácení doby přípravy podkladů pro nové technologie, doby ověřování technologie v kontinuálním uspořádání a v rychlosti zapracování a účinnosti plnoprovozních anaerobních reaktorů. Hlavní uplatnění aktivitních testů je tam, kde klasické technologické metody nedávají dostatek informací. Dalším rozšiřováním použití aktivitních testů v praxi se získají nové podklady pro obecnější zhodnocení jejich vztahu k technologickým podmínkám procesu a zvýší i zpřesní se množství informací, které mohou přinášet.

Rozložitelnost organických látek za anaerobních podmínek

Bilance anaerobního rozkladu organických látek

Anaerobní rozklad čistých organických látek je z hlediska převodu hmoty a energie ze substrátu do produktu dobře znám a definován. V praxi však je často nutné zjišťovat rozložitelnost komplexního substrátu s proměnlivým počtem i poměrem jeho složek. Množství kyslíku potřebné pro oxidaci komplexního substrátu je možné odhadnout ze stanovení chemické spotřeby kyslíku - CHSK. Pro popis kvality substrátu z hlediska jeho energetického obsahu může sloužit ekvivalent dostupných elektronů obsažených v substrátu. V anaerobním systému jsou jiné konečné akceptory elektronů než kyslík, ale na základě vztahu ekvivalentu dostupných elektronů a jednoho molu kyslíku lze používat kyslíkové jednotky ve formě CHSK nebo TSK pro hmotnostně energetickou bilanci (Dohányos a Zábranská, 1988).

Jednoduchým způsobem lze dokázat, že k úplné oxidaci metanu vzniklého z daného substrátu se spotřebuje stejné množství kyslíku jako k oxidaci původního substrátu. Bilance elektronů substrátu obecného složení CxHyOz je dána výrazem 4x + 1y - 2z, což vztaženo na jeden atom uhlíku představuje stupeň redukovatelnosti substrátu :

= 4 + y/x - 2z/x.

Výtěžnost metanu závisí na druhu substrátu, zejména na jeho oxidačním stupni, tj. na množství dostupných elektronů, které má molekula substrátu k dispozici. Čím je vyšší , tím je vyšší i teoretická výtěžnost metanu.

Měřítkem oxidačního stupně organické látky je také průměrné oxidační číslo uhlíkového atomu - POXČ. Čím je POXČ nižší, tím je výtěžnost metanu vyšší. Mezní hodnoty dosahují sloučeniny CO2 (POXČ = + 4 ) a CH4 (POXČ = - 4). Z hmotnostně energetické bilance procesu vyplývá, že POXČ je úměrné teoretické chemické spotřebě kyslíku CHSK dané látky vztažené na množství organického uhlíku:

POXČ = 4 - 1,5*CHSK/Corg

Teoretická hodnota CHSK vzniklého metanu je rovna teoretické CHSK původního substrátu. Z toho plyně, že maximální teoretická výtěžnost metanu je daná vztahem:

CHSKsubstrátu = CHSKmetanu

Skutečná výtěžnost metanu je nižší, protože CHSK zahrnuje i část CHSK biologicky nerozložitelnou a část CHSK substrátu se spotřebuje na růst nové biomasy. Přesnější je bilance odstraněné CHSK:

CHSKodstraněná = CHSKmetanu + CHSKbiomasy

kde:

CHSKodstraněná - skutečně odstraněná (tj. biologicky rozložená) část substrátu v průběhu metanizace, CHSKmetanu - množství vzniklého metanu vyjádřeno v CHSK, CHSKbiomasy - představuje část substrátu spotřebovanou na růst a krytí energetických nároků biomasy. Z výše uvedeného vztahu můžeme na základě provedeného pokusu stanovit produkci biomasy. Produkce biomasy se jinak zjišťuje obtížně, zejména při anaerobním zpracování nerozpuštěných organických materiálů.

Teoretickou výtěžnost metanu vyjádřenou jako hmotnostní množství metanu na hmotnostní jednotku přivedeného substrátu - YCH4mteor - vypočítáme podle vztahu:

YCH4mteor = 0.25 CHSK [g/g] (CH4, substrát)

nebo vyjádřenou jako objem vyprodukovaného metanu na hmotnostní jednotku přivedeného substrátu YCH4gteor - vypočítáme podle vztahu:

YCH4gteor = 0.35 CHSK [l/g] (CH4 *, substrát)

(* - platí pro standardní podmínky, teplota 0oC, tlak 101.3 kPa.)

Pro rychlý převod jednotek jsou uvedeny v tabulce 3.1. přepočtové koeficienty.

1 mol CH4

2 moly O2

64 g CHSK

22.4 l *

1 g CHSK

0.25 g CH4

0.35 l CH4 *

1 g CH4

4 g CHSK

1.4 l *

1 l CH4

2.857 g CHSK

* - platí pro standardní podmínky, teplota 0oC, tlak 101.3 kPa

Tabulka 1. Přepočtové koeficienty jednotek mezi CH4 a CHSK.

Výpočet teoretické koncentrace metanu v bioplynu

Při znalosti POXČ nebo CHSK a obsahu organického uhlíku zpracovávaného substrátu můžeme vypočítat koncentraci metanu v bioplynu podle vztahu:

% CH4 = 18,75 CHSK / Corg

nebo při znalosti POXČ substrátu:

Při výpočtu skutečné koncentrace metanu v bioplynu je nutno provést korekci na CO2 rozpuštěný nebo vázaný v kapalné fázi fermentační směsi. Rozpustnost metanu ve vodě je zanedbatelná.

V případě přítomnosti dalších prvků v molekule substrátu, které v oxidoredukčních reakcích jsou akceptory volných elektronů, dochází ke snížení množství elektronů pro tvorbu metanu a tím ke snížení výtěžnosti metanu. Takto působí zejména dusík a síra a jejich sloučeniny, které jsou častou složkou anaerobně zpracovávaných materiálů. Míra ovlivnění závisí na oxidačním stupni daného prvku, pro korekci výtěžnosti metanu je třeba od celkové CHSK odečíst CHSK substrátu spotřebovaného na redukci kyslíku a síry.

YCH4mteor = 0.25 (CHSK-N-S) [g/g] (CH4, substrát)

nebo

YCH4gteor = 0.35 (CHSK-N-S) [l/g] (CH4 *, substrát)

kde N je kyslíkový ekvivalent dusičnanového a dusitanového dusíku a S je kyslíkový ekvivalent síry:

N = 2.86 (NO2-N + NO3-N) [g] (O2,CHSK)

S = 2 (Scelková) [g] (O2,CHSK)

Stanovení anaerobní rozložitelnosti organických látek

Pro stanovení a vyjádření anaerobní rozložitelnosti je třeba testovanou látku nějakým způsobem definovat. Je možné vycházet z hmotnostního množství, z obsahu organického uhlíku v testované látce a jeho průměrného oxidačního čísla nebo z její specifické CHSK [g/g]. Rozložitelnost je potom vyjádřena jako množství Corg přeměněného na bioplyn z celkového množství Corg nebo CHSK přeměněného na metan z celkového množství CHSK, eventuelně z celkového hmotnostního množství testované látky. Podmínky testu rozložitelnosti jsou voleny pro limitní anaerobní rozklad (ISO CD 11734).

Limitní anaerobní rozklad znamená, že proběhly všechny fáze anaerobního rozkladu, látka je spotřebována anaerobními mikroorganismy a výsledné produkty jsou CH4 a CO2, minerální soli a nová biomasa. Primární rozklad je úroveň rozkladu, kdy látka prochází pouze strukturálními změnami jako výsledek mikrobiální činnosti a není ještě úplně mineralizována. Pokud potřebujeme sledovat primární rozklad, je ovšem nutné použít speciální analytickou techniku pro testovanou látku.

Inokulum je funkční anaerobní biomasa, která obsahuje co nejširší škálu skupin aktivních mikroorganismů. Zdrojem mohou být anaerobní reaktory se suspenzní biomasou vyrostlou na rozpustném organickém znečištění nebo anaerobní stabilizační nádrže zpracovávající organické látky v suspendované formě - kaly. První typ inokula je vhodnější, protože obsahuje méně inertních nebo nerozložených suspendovaných organických látek. Je snaha, aby inokulum mělo co nejnižší vlastní produkci plynu - tzv. "endogenní" a co nejnižší obsah anorganického uhlíku. Množství inokula se uvádí jako sušina nerozpuštěných látek při 105oC - (NL), podíl biomasy nejblíže vyjadřuje organický podíl nerozpuštěných látek (NLorg).

Teoretická substrátová produkce CH4 (TVCH4s) ml je maximální možná produkce metanu při 100% rozkladu testované látky, vypočítaná z mg CHSK přidané v testu * 0,35 pro standardní podmínky: 101,3 kPa, 0oC nebo z mg CHSK přidané * 0,31 pro reálné podmínky: 101,3 kPa, 35oC

Substrátová produkce bioplynu nebo CH4 (VBPs, VCH4s) je objem vyprodukovaného plynu nebo CH4 po odečtení endogenní produkce z celkové produkce. Tento objem bioplynu nebo CH4 vzniklý rozkladem přidaných organických látek v porovnání s teoretickou substrátovou produkcí udává anaerobní biologickou rozložitelnost daného materiálu, pokud je inokulum promyté a vyhladovělé a je nízká endogenní produkce plynu - pozadí. Jinak může k produkci bioplynu z daného substrátu přispívat rozklad organických látek vnesených s inokulem (produkční příspěvek inokula), potom může substrátová produkce dosahovat vyšších hodnot než je teoretická a výsledek testu je pro stanovení rozložitelnosti nepoužitelný.

Produkční příspěvek inokula (PPI) je zvýšení substrátové produkce bioplynu nad teoretickou hodnotu intenzivnějším rozkladem organických látek přítomných v inokulu na počátku testu (pozadí) než je tomu v referentním testu, způsobeným stimulačním působením kofermentace s lépe rozložitelným substrátem.

Provedení testu rozložitelnosti je stejné, jako u testů metanogenní aktivity, liší se pouze v detailech dávkování substrátu, biomasy a v podmínkách testu. Metodu lze aplikovat jak na organické látky rozpustné ve vodě, tak na špatně rozpustné ve vodě za předpokladu, že je vybrána vhodná metoda dávkování, pokud nevykazují inhibiční efekt k testujícím mikroorganismům. Těkavé látky vyžadují speciální přístup měření bez odpouštění vyprodukovaného bioplynu pomocí tlakového senzoru.

Objem plynového prostoru bývá 0,10 - 0,35 násobkem celkového objemu, podle způsobu měření plynu. Optimální velikost celkové produkce plynu vzhledem k přesnosti stanovení je závislá na objemu plynového prostoru, měla by být jeho 0.3-3 násobkem a dosahuje se vhodným ředěním substrátu. Doporučuje se udržovat odhadovaný rozložitelný podíl CHSK v naředěném vzorku do 2 g/l. Promyté inokulum je resuspendováno do roztoku obsahujícího pufr, živiny a testovanou látku v takovém množství, aby výsledná koncentrace NLorg inokula byla v rozmezí 1 - 2,5 g/l. Testovaná směs je probublána dusíkem (pokud neobsahuje těkavé látky) a plynotěsně uzavřena septem. Poté je umístěna do prostoru temperovaného na 351oC, počátek testu se počítá po vyrovnání tlaků (Zábranská et al., 1990).

Dále je v určitých intervalech podle rychlosti produkce měřen vyprodukovaný plyn. Před každým měřením je obsah baňky promíchán, kontinuální míchání není v testech nutné, směs je dostatečně míchána bublinkami vznikajícího plynu. Plyn je možno měřit objemově plynovou byretou nebo tlakově pomocí tlakového senzoru. Tlakový senzor umožňuje kontinuální měření, pokud je napojen na registrační zařízení. Intervaly měření jsou voleny podle rychlosti produkce plynu, ze začátku testu i několikrát za den, potom obvykle denně, ke konci testu mohou být intervaly měření až týden.

Před testem je nutné inokulum pečlivě promýt opakovanou dekantací nebo centrifugací, resuspendace se provádí buď v pufrovacím mediu nebo v kyslíku zbavené vodovodní vodě. Doporučuje se nechat spotřebovat nerozložené organické látky v kalu několikadenní kultivací při 35oC. Delší doba bez přísunu substrátu již může způsobit lagovou fázi na začátku testu. S kalem je třeba zacházet tak, aby byl co nejméně ve styku s kyslíkem. Testovaná látka může být přidána jako roztok, suspenze, emulze o známé koncentraci nebo přímo jako pevná látka nebo kapalina. Důležitá je homogenizace přidané látky do celého objemu kultivační směsi.

Jako paralelní kontrolu aktivity inokula je možno nasadit stejný test s referentní látkou se známou hodnotou anaerobní rozložitelnosti. Referentní látkou bývá benzoát sodný, fenol a pod. a měla by být dosažena rozložitelnost větší než 60%. Inhibiční účinky sledované látky se mohou zjistit dalším testem, kde je substrátem stejné množství sledované látky a referentní látky (ISO CD 11734).

Vyhodnocení výsledků podle CHSK: Anaerobní rozložitelnost DCHSK se počítá z poměru substrátové produkce metanu zjištěné v testu a teoretické substrátové produkce vypočítané z CHSK přidaného substrátu ( TVCH4s) podle vztahu:

DCHSK = VCH4s . 100/(TVCH4s) [ % ]

Reálná i teoretická produkce metanu musí být vypočítána pro stejnou teplotu. Pokud je použit pro výpočet teoretické produkce koeficient 0,35, pak je nutné přepočítat reálnou produkci na standardní podmínky. Pro reálné objemy metanu měřené při 35oC je koeficient výpočtu teoretické produkce 0,31. Při tomto výpočtu rozložitelnosti je zanedbána tvorba nové biomasy a rozpustnost metanu v kapalné fázi, protože obě hodnoty jsou velice nízké. Pro vyhodnocení je třeba znát obsah metanu v bioplynu.

Autor: Prof. Ing. Jana Zábranská, CSc., VŠCHT, Praha

 
 

Newsletter

Hlavní partneři

Inzerce